生物膜结构是生物体重要的组成单元之一,生物体内许多生命活动都与膜结构有关,如物质转运、能量转换、信号识别与传递等[1]。生物膜结构的稳定性及流动性是其发挥正常生理功能的前提。在生理状态下,处于液晶态,既保留了晶态分子的有序排列,又具有液态分子的流动性[2,3,4]。外界温度的变化会影响膜的流动性,因此研究温度对生物膜结构的影响,对于进一步理解生物膜的结构和功能,探索与细胞膜相关的生命活动的内在机制,及更好地发挥药物的治疗作用有着非常重要的意义。

随着现代分析技术的快速发展,许多新技术逐渐被用于生物膜领域的研究,主要有电磁波谱法[5,6,7]、显微镜技术[8]、以及差示扫描量热技术[9]、电子自旋共振法[10]、电化学法[11]等。虽然借助传统的实验技术,人们对生物膜的基本组成形态和功能已经有了比较清晰的认识,但是目前的研究结果基本是基于数据分析推测而来,没有直观的数据作为支撑。计算机模拟技术的快速发展及其在生物学医学领域的广泛百富策略白菜网,为生物膜的研究提供了一种直观高效的方法。部分科研机构已将其百富策略白菜网于生物膜研究,并取得了一定的成果[12,13]。其中介观动力学是研究此类问题最常用的模拟方法,它具有较高的计算效率,可进行相对于原子或分子层面更大的空间与时间尺度的模拟。粗粒化粒子之间的相互作用称之为粗粒化力场,粗粒化粒子是在粗粒化力场的控制下运动[14]。Martini力场是Marrink团队开发的主要适用于脂质、聚合物、糖类及糖脂类化合物的粗粒化力场[15,16]。

磷脂双分子层是构成生物体膜结构的基本骨架,膜的流动性与脂质分子在膜中的运动及排布形式密切相关[17]。二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)是大多数哺乳动物细胞膜的主要成分,由于其相变温度接近生理温度,近年来作为模拟生物膜的模型而被广泛百富策略白菜网。本文以DPPC磷脂双分子层为载体,采用基于Martini力场的介观模拟方法探讨温度对生物膜结构、形态和功能的影响,为深入认识生物膜中的有序结构及研究药物与生物膜的相互作用奠定基础。

本文所有模拟工作均基于Materials Studio5.5 (MS5.5)[18]材料模拟平台(美国Accelrys Inc.)展开。DPPC分子结构从Pubmed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)中检索下载,采用基于全原子力场的分子动力学模块Discover进行Smart Minimizer能量最小化预处理,力场选用包含磷原子的cvff力场[19]。依据Martini力场的粗粒化规则,采用Mesocite介观模块对能量最小化后的分子进行粗粒化,结果见图1。DPPC分子中的胆碱基团粗粒化为带一个正电荷的NC珠子(深蓝色表示,赋予Q0力场),磷酸基团粗粒化为带一个负电荷的PO珠子(紫色表示,赋予Qa力场),2个甘油酯基团粗粒化为2个GL珠子(橙色表示,赋予Na力场),2条烷烃尾链各粗粒化为4个C珠子(分别命名为C1～C4,玫粉色表示,赋予C1力场)。粗粒化后的分子采用Mesocite模块进行能量最小化处理,然后采用MS自带的介观建模工具搭建磷脂双分子层(见图1),建模盒子大小为200×50×1003,脂层厚度为44,初始密度为1.0 g/cm3,填充DPPC磷脂分子328个(每层164个),粗粒化的水珠子5050个(～61 real waters/lipid)。搭建好的DPPC双层膜分为3个部分:(1)亲水区,包括NC和PO珠子;(2)栅栏区,主要为GL珠子组成;(3)疏水区,由烷基尾链C珠子组成。

温度对磷脂分子间相互作用有一定的影响,在不同温度下,生物膜中磷脂分子将呈现出不同的构象。据文献报道,DPPC磷脂双分子层的相转变温度约为315 K[20],为了考察温度对DPPC磷脂双层膜结构的影响,本文设置255 K、285 K、315 K.、345 K、365 K共5个温度进行模拟。首先对2.1中搭建的DPPC磷脂双分子层进行4次(根据实际体系需要酌情选择优化次数)不同精度的能量最小化,参数设置参考2.1。在运行长程动力学之前,需要对能量最小化后的模型进行400 ps的动力学以平衡结构,时间步长为20 fs,NPT系综(N为粒子数,P为体系压力,T为模拟温度),体系压力为1 bar,采用Berendsen压力耦合函数,时间间隔为1.0 ps,温度控制采用velosity scale耦合函数,时间间隔为1.0 ps。对于静电相互作用,采用Ewald方法处理,范德华相互作用采用Bead based方法,截断距离均为14.平衡后的结构运行12000 ps的长程动力学模拟,参数设置参考平衡动力学设置,时间步长为30 fs,最后5400 ps用作结果分析。

APL为单个磷脂在脂质双层膜平面所占的面积,由式APL=<2ab/N>计算而得,其中a、b分别为DPPC双层膜平面的长和宽,N为体系中DPPC分子的总数,<>表示时间平均。APL值一方面可以说明体系中DPPC磷脂分子横向(即水平方向)排列的疏密程度,另一方面其随时间的变化可以用来判断体系是否达到平衡。由图可知,不同温度下,DPPC双层膜体系在5000 ps以后均已达到平衡状态(图2(a)),且体系APL值随温度升高而增加(见图2(b)),由64.0851(255 K)增加到68.8381(365 K),与核磁共振法研究结果64(323 K)相近[21]。体系温度为285 K时,APL值在4000 ps发生了急速下降,推测与体系预相变有关。在285 K以下,体系APL值随温度上升变化较缓慢,到315 K时显著增加,说明由于温度的升高,热能的增加破坏了磷脂头基间的相互作用,使得磷脂头基间自由空间增大,磷脂尾链运动更加自由,导致体系发生了相转变,由晶态转变为液晶态。

磷脂双层膜厚度表征体系中DPPC磷脂分子纵向堆叠情况,可由平衡时体系NC珠子的相对浓度分布曲线(见图3(a))两峰间的水平距离(即上下两层磷脂头基胆碱基团之间的距离,dH-H)计算而得。从图3(a)可以看出,脂水界面过渡明显,并且当GL珠子(即甘油基团)相对浓度达到最大值时,水的浓度降低为零,说明脂质双分子层中心区没有水分子的存在,为完全疏水环境。由此可知,甘油酯基团组成的栅栏区是影响分子透过的最大阻碍,这在一定程度上解释了皮肤的屏障功能。图3(B)为不同温度下双层膜厚度的变化。由图可知,DPPC双分子层厚度均小于2个DPPC分子的长度,说明双层膜中DPPC分子尾链的纵向排列有一定的交叉折叠。随温度升高,DPPC双分子层厚度逐渐减小,说明DPPC的烷基尾链发生了弯曲折叠或交叉排列。当温度低于285 K时,变化幅度较大,285 K以后,变化幅度减缓,推测与DPPC膜体系发生预相变有关[22]。当温度为315 K时,曲线出现拐点,说明体系发生了相转变。

径向分布函数是指以给定的参考粒子α为中心,其他粒子β在空间的球对称径向分布状态,是研究非晶态结构的有效方法,既可用来描述粒子的有序性,也可用来描述粒子的相关性[23]。根据Hansen等[24]的定义,径向分布函数gaβ(r)的计算公式如下:

其中,xi为体系内i粒子的摩尔分数,Ni为体系内i粒子的个数,N为体系总粒子数,ρ为体系粒子数密度,r为粒子i与参考粒子的距离。

对于DPPC膜体系,头基PO珠子的径向分布函数可说明DPPC头基间的距离,见图4可以看出,随着温度的升高,径向分布函数整体向右偏移,说明温度升高,使得DPPC头基间距增大,自由体积增加,DPPC横向排列更加疏松,与APL结果一致。

温度改变对膜中DPPC分子的存在构象会有一定的影响,其中变化最显著的就是DPPC头基GL-PO-GL键角α(见图5(a))和烷基尾链长度L (见图5(b))。键角α的变化主要影响DPPC分子的横向排布情况,即与APL的变化密切相关。尾链长度L的变化则主要反映DPPC膜纵向排布情况,即与膜厚度变化相关.由图中可以看出,随着温度的升高,键角α的分布曲线先右移后逐渐左移,说明键角α随温度的升高先增大后减小。而图2(b)中脂均面积APL是一直增大的,结合图4中PO珠子的径向分布函数分析可知,DPPC分子间隙增加是导致DPPC膜脂均面积增大的主要原因。由图5(b)可以看出,随着温度的升高,DPPC分子尾链长度分布曲线逐渐左移,即尾链长度趋于减小。结合脂均面积和膜厚度数据分析,低于315 K时,体系处于排列紧凑有序的晶态,由于头基间自由空间较小,使得磷脂分子尾链没有足够的空间发生折叠弯曲,处于较伸展的“僵直”状态,故膜厚度较大,脂均面积较小;当温度升高,热能增加,头基间相互作用减弱,磷脂分子尾链间自由运动的空间增大,尾链更加趋于弯曲折叠的“柔软”状态,使得膜厚度减小,脂均面积增加,更有利于膜内外物质的跨膜转运,能量的传递,从而维持细胞的基本形态和功能,这在一定程度上解释了生物体的自我调节能力。

对于平衡体系,由于粒子间的相互碰撞作用会将粒子推离原始位置,其质心运动轨迹类似于数学上的随机漫步。t时刻某粒子偏离原始位置的位移的平方即为该粒子的均方位移MSD,计算公式如下:

其中,ri为粒子i质心的位置向量,t为时间,<>表示系综平均。由于随机漫步粒子移动距离的平方的平均数与时间成正比,故由MSD曲线的斜率可求出粒子的扩散系数D,计算公式如下:

本文通过计算不同模拟温度下DPPC分子尾链末端碳珠子(EC)的扩散系数,表征温度对DPPC膜流动性的影响,结果见图6。从图中可以看出,在模拟的温度范围内,EC珠子的扩散系数随温度升高总体呈上升趋势,在315 K时达最大值。结合APL数据及Na-Qa-Na键角的变化分析可知,温度升高使得DPPC尾链疏水区的自由空间增大,DPPC磷脂尾链运动阻力减小,增加了DPPC膜的流动性。而在315 K时DPPC膜发生相转变,使得末端碳珠子的扩散系数出现较显著的变化。

旋转自相关函数是描述分子或基团的旋转扩散运动的指标,既是一个随时间变化的动态量,也是对系综平均的静态描述,不仅可用来表征体系的平衡,也可用来评价体系的有序性,其计算公式如下:

其中,u(t)为t时刻描述分子或基团空间取向的向量。M(t)为1时,表明向量u(t0)与u(t0+t)平行,分子取向完全相关,M(t)值越小,分子取向相关性也越小。

图7(a)为315 K下不同基团空间取向向量的RTCF随模拟时间的变化图。由图可知,在模拟的时间范围内,各体系均已达到平衡状态,其中GL-C1向量的旋转自相关性最强,表明在DPPC双层膜体系中GL-C1向量排列最有序,进一步解释了甘油酯基团对水分子透过的阻碍作用,与文献描述一致[22]。而C3-C4向量空间取向相关性最低,证明DPPC分子尾链末端旋转运动最自由,分子排列有序性在DPPC分子尾部区域最小。图7(b)为C3-C4向量在不同模拟温度下的RTCF曲线,从图中可以看出温度越高,C3-C4向量的旋转自相关性越小,并且达到平衡所需的时间也越短,说明温度越高,DPPC尾链排列越无序,膜疏水区流动性也越大。

本文以DPPC磷脂双层膜为载体,通过粗粒化的计算机模拟研究,获得不同温度对DPPC磷脂双层膜形态功能的影响,通过研究得到如下结论:(1) 315 K为DPPC膜的相转变温度,低于315 K,DPPC膜处于晶态,高于315 K时处于液晶态;(2)温度升高,破坏DPPC头基间相互作用,导致分子间隙增加,膜流动性、脂均面积增大,膜厚度减小;(3)甘油酯基团组成的栅栏区为DPPC膜中阻碍小分子透膜的主要屏障。本文在前人研究成果的基础上,从更深层次阐释了生物膜的形态和功能之间的关系,明确了温度影响生物膜结构和功能的调节机理,一方面可为某些疾病的治疗以及临床用药提供指导,另一方面可为人工膜的研制提供参考。