干扰素 (Interferon, IFN) 是一种广谱抗病毒的蛋白类药物, 临床上广泛用于治疗肿瘤、 病毒性肝炎、 疱疹病毒性口角炎等疾病[1], 主要通过肌肉注射IFN溶液或其它用药途径进行. 但IFN在体内的稳定性差、 滞留时间短、 利用率低. 为解决上述问题, 可将IFN进行PEG (聚乙二醇) 修饰, 制备稳定长效的干扰素, 如罗氏公司的产品派罗欣 (PEG化rhIFN α2a) . 而脂质体 (Liposome, LP) 作为新型的用药途径, 不仅有稳定长效功能, 而且有靶向功能, 并可减少药物毒性, 因此人们将脂质体作为蛋白类药物及生物酶的载体进行研究[2,3,4,5]. 目前已有两性霉素B (商品名有Amphotec等) 、 阿霉素 (商品名Doxil) 、 柔红霉素B (商品名Dauno Xome) 等化学药物脂质体产品已用于临床医疗, 但蛋白类药物脂质体还只处于临床试验阶段, 如2004年深圳海王英特龙公司试验的干扰素脂质体 (IFN-LP) 乳膏获得临床批文, 2004年9月美国Biomira公司的BLP25脂质体已进入临床三期试验[6]. 目前, IFN-LP存在包封率低, 泄漏率高, 粒径稳定性差等缺陷, 严重地限制了其工业化进程.

本文从分子水平上分析磷脂分子与干扰素的各自特点, 筛选出制作脂质体的磷脂, 并对其外观形态、 粒径及包封率和稳定性进行了考察.

旋转蒸发仪 (Laborota 4000, Heidolph, Germany) ; 高压匀浆机 (Emusiflex C3, Avestin, Canada) ; 水浴式超声仪 (B2200S-T, Brandson, USA) ; 紫外检测仪 (8823B, 北京宾达英创仪器设备有限公司) ; 记录仪 (3057 Portable Recorder, 重庆川仪四厂) ; 粒度分析仪 (Mastersizer2000, UK) ; 透射电子显微镜 (JEM-2010, Japan) , 差示热量扫描仪 (DSC204 F1 phoenix, NETZSCH , Germany) .

氯仿、 乙醚、 无水甲醇等为分析纯试剂, 二肉豆蔻酰胆碱 (DMPC) 、 二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC) 、 二肉豆蔻酰丝氨酸 (DMPS) 为美国Avantilipids产品; L-α-卵磷脂 (L-α-Phosphatidylcholine, LPC) 、 胆固醇 (Chol) 、 维生素E (VE) 、 硬酯胺 (SA) 为美国Sigma公司产品.

通过基因重组技术, 在大肠杆菌中表达, 并纯化得到具有生物活性的重组人干扰素alpha 2b (rhIFNα 2b) 蛋白. 4种磷脂膜材组合分别为: A (LPC) , B (LPC+PS) , C (LPC+DMPC+SA) , D (DPPC+DMPC+SA) , A磷脂膜材电荷为中性, 相变温度低; B膜材带负电荷; C, D膜材带正电荷, 但D的相变温度比C的高.

用薄膜蒸发法 (FEM) 制备脂质体膜[7], 分别用A, B, C, D为膜材, 按相同比例加入Chol和VE, 在氯仿-甲醇中复合溶媒溶解, 于37 ℃旋转蒸发成膜, 加入含有IFN的磷酸缓冲液作为水相, 水化磷脂膜, 再超声处理, 用高压匀浆机匀浆, 得到A-LP, B-LP, C-LP, D-LP脂质体样品, 于4 ℃保存待用.

选用磷脂组合C (LPC+DMPC+SA) 作膜材, 分别用薄膜蒸发法、 反相蒸发法 (RPE) 以及钙融合法 (CIF) 制备干扰素脂质体[8], 再超声处理, 用高压匀浆机匀浆, 于4 ℃保存待用.

将适量的干扰素脂质体加入到Shepharose G100层析柱 (ϕ 1.6 m×25 mm) 中, 以36 mL/ (cm2·h) 的线速度上样, 用磷酸缓冲液进行洗脱, 收集第一和第二峰, 测定各峰样品活性. 包封率\, 活性保留系数\, 脂质体峰活性和干扰素峰活性分别按下面各式求出:

包封率=活性保留系数×脂质体峰活性/ (脂质体峰活性+干扰素峰活性)

活性保留系数=干扰素脂质体的活性/最初投入干扰素总活性

脂质体峰活性=脂质体峰取样活性 (IU/mL) ×脂质体峰样品总体积 (mL)

干扰素峰活性=干扰素峰取样活性 (IU/mL) ×干扰素峰样品总体积 (mL)

本文采用的包封率与药典规定的有所不同, 主要是考虑到脂质体的制备过程中蛋白药物活性会出现损失, 因此添加活性保留系数. 干扰素活性测定方法采用中国药典附录WISH细胞病变抑制法[9].

从图1和图2可以看出, 4种脂质体的平均粒径和跨距在0～60 d内都有不同程度的增大, 在制备后的0～5 d内基本稳定, 在7～30 d内快速增大, 在30～60 d内变化为平缓增大.

这是由于脂质体制备过程结束后, 可能有一个自组装 (Self assembly) 及相对稳定的平衡过程[10], 所以在0～5 d, 粒径变化不明显; 而7 d后, 可能是由于A-LP的磷脂膜静电荷几乎为零, 脂质体颗粒之间的电荷排斥作用小, 更容易凝聚甚至融合, 导致粒径增大, 均匀度变差; 而B-LP, C-LP, D-LP颗粒之间存在电荷排斥力, 其粒径变化没有A-LP的明显. 而对于B-LP, C-LP和D-LP, 用差示热量扫描仪测定其相变温度分别为13, 16和27 ℃, 相变温度的差异带来粒径稳定性的差异, 在4 ℃保存的膜中的磷脂分子的流动性也按B, C, D顺序递减, 而流动性越小, 粒径也越稳定.

脂质体的层析分离过程如图3所示, 第一峰出现在13～15 min, 为脂质体峰, 第二峰在35～37 min出现, 为游离干扰素峰, 测定各峰样品活性, 计算包封率, 结果如图4所示. 由图4可见, 在0～60 d内, 样品的包封率都有下降趋势, A-LP和B-LP的包封率始终比C-LP和D-LP的低, 但A-LP的包封率在0～8 d内比B-LP的高, 其下降速度也比B-LP的大, 在13～60 d内其包封率比B-LP, C-LP和D-LP的低, 在0～16 d内则大致相当, 但在18 d后开始出现变化, C-LP的包封率比D-LP的小.

被包裹的IFN不仅存在于被脂质体颗粒包裹的水相中, 而rhIFNα 2b分子在pH=7.0的溶液中带负电荷, 容易吸附到带正电荷的脂质体膜上, 因此C和D的包封率明显比不带电荷A的高, 由于B磷脂膜带负电荷, 与rhIFNα 2b间有电荷排斥力, 故制备后0～7 d的B-LP包封率比不带电荷A-LP的低, 由于A-LP的粒径跨度变化大, 颗粒出现融合、 破碎, 包封率下降较快, 而B粒径稳定性稍好 (见图1和2) , 包封率变化较小, 所以在13～60 d内B的包封率比A的大, 而C和D的包封率在16～60 d内也出现差异, 这可能是颗粒相互融合带来了粒径变化的差异, 导致被包封的IFN泄漏, 使包封率变小.

经负染法染色后, 脂质体颗粒呈现白色, 背景为黑色. 4种脂质体都为单层脂质体, 大多数呈圆形, 边缘平整[见图5 (A) ], 形态上并无明显的差异; 由图5 (B) 可见, 2个脂质体颗粒出现部分融合, 这可能是表面张力导致小颗粒凝聚在一起, 由于膜分子的运动及自我平衡过程导致颗粒的融合, 变为较大的颗粒; 而融合也导致被包裹的IFN溶液泄露, 引起包封率下降. 由图5 (C) 可以看出, 几个脂质体颗粒聚集, 凝聚有可能导致融合, 引起粒径和跨度增大. 这也可以通过改变膜材中胆固醇的比例来改变膜中磷脂分子的流动性, 稳定脂质体颗粒.

综合考虑, 以D磷脂 (DMPC+DPPC+SA) 为膜材, 制备的IFN-LP有较好的包封率, 在4 ℃保存, 可稳定保持60 d.

从图6和图7可以看出, 3种方法制备的脂质体平均粒径和跨度都有增大的趋势, FEM-LP和RPE-LP的粒径和跨度变化相似, CIF-LP粒径最大, 其跨距变化最大. 这可能是因为LPC是一种混合物, 某些磷脂分子含有酸性的极性基团, 钙离子的存在与酸性磷脂分子相互作用, 引起膜的融合、 凝聚[见图5 (B) , 5 (C) ], 因此CIF-LP的平均粒径远比其它两者的大, 而其它两种脂质体溶液中, 没有引入钙离子这种诱导因素, 从跨度稳定性来看, 用薄膜蒸发法及反相法优于用钙融合法. 从粒径的大小和稳定性来看, 用钙融合法劣于用其它两种方法. 正因为LPC具有可适用不同制备方法的特性, 所以采用C组合考察制备方法的优劣.

如图8所示, RPE-LP的包封率在整个考察过程中都比用其它方法的低, 而CIF-LP的包封率在0～8 d内比用薄膜法的大, 在8～60 d内比用薄膜法的小. 这主要是因为反相蒸发过程中有机溶剂和IFN蛋白相互接触, 容易导致IFN蛋白变性, 损失大量活性. 而CIF-LP粒径在0～8 d内其平均粒径大, 包裹的IFN多, 但到了后期, 融合和破碎的脂质体增加, 包裹的IFN泄漏率增大, 所以包封率下降速度快, 最终比FEM-LP包封率低. 因此, 从粒径和包封率的角度考虑, 用薄膜法制备的IFN脂质体较优.

FEM-LP与RPE-LP颗粒比较均一, 边缘比较圆润[图9 (A) ], 从颗粒形态上很难判断这两种制备方法的优劣, 而CIF-LP颗粒中[图9 (C) ], 有些为多层脂质体, 多数颗粒外形接近圆形, 边缘不够平整, 箭头1所指为颗粒融合后的部分单位膜, 凸起的部分还未能完全整合到颗粒中, 箭头2所指的是部分多层脂质体最外层的单位膜. 这是因为钙融合法制备的脂质体大多是多层脂质体, 而匀浆处理后, 仍然有少量多层脂质体, 钙离子的存在也诱导了脂质体的膜融合及凝聚等变化[图9 (B) 和 (C) ], 所以呈现的颗粒形态不很均一. 因此从颗粒形态、 粒径、 包封率来看, 薄膜法优于其它两种方法.

综合分析, 对于包裹rhIFN的脂质体, 采用DMPC+DPPC+SA的复合磷脂作为膜材, 用薄膜蒸发法较为适合. 而关于蛋白类药物脂质体的最佳膜材组合、 最佳制备方法及其相应包封率, 有很多不同的研究报道[2,11,12]. 本文所选用的材质种类和组合, 以及所采用的制备方法在数量上有限, 还有待于进一步研究.