包封率是评价脂质体质量的重要指标,也是脂质体能否发挥较普通制剂高效、低毒作用的基础[1,2]。测定脂质体包封率常见方法有柱色谱法[3,4]、微柱离心法[5,6,7,8,9,10]、超滤离心法[11,12]、透析法[13]、离子交换色谱法[14,15]和柱切换法[16]等。相比较其他方法而言,微柱离心法具有操作简便、分离时间短、样品用量少、脂质体被稀释倍数小等优点,已被广泛用于脂质体包封率的测定。

在用微柱离心法测定脂质体包封率之前,首先要进行脂质体柱回收率的方法学研究以确保所得包封率结果真实可信。现有文献几乎都以浊度法来测定脂质体柱回收率。浊度是光线与制剂中悬浮颗粒相互作用的结果,它表征光线透过制剂时受到阻碍的程度。悬浮颗粒大小及分布会对浊度法测量结果产生影响[17,18]。浊度法测定脂质体柱回收率的基础是脂质体过柱前后混悬液在波长400 ~ 500 nm处的光密度变化,脂质体的粒径大小及其分布会影响测量结果准确性。

胆固醇( cholesterol,CH) 是脂质体膜材的重要组成部分,其分子结构式( 图1) 中羟基端与磷脂头基相结合朝向亲水面,甾醇环和疏水环基链插入磷脂双分子层疏水区,可在脂质体中稳定存在[19]。通过测定CH质量浓度就能准确反映脂质体浓度,根据过柱前后CH质量浓度变化值准确评价脂质体柱回收率。

作者用改良乙醇注入法制备了不同粒径的空白脂质体,分别以浊度法和膜材( CH) 测定法考察不同粒径空白脂质体在阳离子交换纤维微柱、阳离子交换树脂微柱和葡聚糖凝胶微柱上的回收率,进而对浊度法与膜材测定法在评价脂质体于不同微柱回收率上的优劣进行比较,以期规范并指导脂质体柱回收率的测定方法。作者首次将浊度法测得的脂质体柱回收率定义为脂质体“表观柱回收率”,将膜材测定法所得的脂质体柱回收率定义为脂质体“实际柱回收率”,并提出“相对偏离度”量化“表观柱回收率”偏离“实际柱回收率”的方向与程度; 另外,还对洗脱过程中脂质体的粒径进行了检测。

PHS-25 p H计 ( 上海精密科学仪器有限公司) ,Anke TDL80-2B离心机( 上海安亭科学仪器厂) ,JY92-2D超声波细胞粉碎机( 宁波新芝科器研究所) ,756 MC紫外-可见分光光度计( 上海第三分析仪器厂) ,Nicomp-380激光粒度测定仪( 美国Particle Sizing Systems公司) ,P230高压恒流泵、Echrom 2000 DAD色谱数据处理工作站( 大连依利特分析仪器有限公司) ,SEDEX75蒸发光散射检测器( 法国Sedere公司) ,AT-130柱温箱( 天津金洲科学仪器有限公司) 。

氢化大豆磷 脂 ( hydrogenated soybeanphosphatidylcholine,HSPC,德国Lucas Meyer Cosmetics公司) ,胆固醇( cholesterol,CH,南京新百药业有限公司) ,ZB-1强酸钠型阳离子交换纤维( 桂林正翰科技开发有限责任公司) ,732阳离子交换树脂( 国药集团化学试剂有限公司) ,葡聚糖凝胶G50( Sephadex G-50,上海试剂厂进口分装) ,无水乙醇( 药用级,安徽安特生物化学有限公司) ,甲醇( 色谱纯,天津大茂化学试剂厂) ,灭菌注射用水( 沈阳军区总医院) 、蒸馏水( 自制) 。

将HSPC、CH以质量比3∶1制备2批空白脂质体,分别记为L1、L2,处方组成及用量见表1。精密称取处方量的HSPC和CH置25 m L西林瓶中,加入无水乙醇后,于65℃水浴中搅拌使其完全溶解,注入预热至相同温度的灭菌注射用水并在65℃水浴中继续搅拌20 min,得空白脂质体初品。将初品在冰水浴中以超声波细胞粉碎机处理( 200 W×2 min、400 W×6 min) 后,再依次通过0. 8、0. 45μm微孔滤膜各3次,即得空白脂质体。其中,由于L1粒径较大,只通过0. 8μm微孔滤膜3次,未能通过0. 45μm微孔滤膜; L2可顺利通过0. 8、0. 45μm微孔滤膜各3次。对L1和L2的粒径进行测定,其粒径和跨距( CV) 结果见表2。

按“2. 1. 1”条L1脂质体处方中不加CH,之后同法制备,即得不含胆固醇空白脂质体。

精密称取CH标准品适量,加甲醇溶解,制成质量浓度为1. 0 g·L- 1的CH溶液,即得CH对照溶液。

精密量取“2. 1. 1”条空白脂质体100μL置10 m L量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得含胆固醇的空白脂质体样品溶液。

精密量取“2. 1. 2”条不含胆固醇的空白脂质体100μL置10 m L量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得不含胆固醇的空白脂质体样品溶液。

色谱柱: DiamonsilTMC18柱( 200 mm×4. 6 mm,5μm) ; 流动相: 甲醇; 流速: 1. 0 m L·min- 1; 柱温: 30℃ ; 进样量: 20μL; ELSD检测器参数: 漂移管温度85℃,增益值8,载气压力200 k Pa。

分别取“2. 2. 1”及“2. 2. 2”条各溶液 各1. 0 mL ,用甲醇稀释至10 m L,按“2. 2. 3”条色谱条件取20μL分别进样,记录色谱图。由图2可知,CH保留时间约为16. 2 min,与其他组分分离良好,该色谱条件可用于脂质体中CH的含量测定。

取“2. 2. 1”条的CH对照溶液适量,分别用甲醇定量稀释制成每1 m L中含CH 0. 05、0. 10、0. 20、0. 50和1. 00 mg; 分别精密量取不同质量浓度溶液20μL,注入液相色谱仪,记录CH峰面积,以CH对照溶液质量浓度的对数值与相应的峰面积对数值进行线性回归,得CH的标准曲线为:lg A = 2. 112 lgρ + 4. 905 2,r = 0. 999 9。结果表明CH在质量浓度0. 05 ~ 1. 0 g·L- 1内与峰面积线性关系良好。

取“2. 2. 5”条质量浓 度为0. 10、0. 20和0. 50 g·L- 1CH对照溶液适量,分别于2、4、6、8和10 h各测定1次,以所得峰面积求算日内相对标准偏差; 分别于1、2、3、4和5 d各测定1次,以所得峰面积求算日间相对标准偏差。结果表明在该色谱条件下,相对标准偏差均小于2. 0% ( 表3) ,符合精密度试验的要求。

取“2. 2. 5”条质量浓 度为0. 10、0. 20和0. 50 g·L- 1CH对照溶液,按“2. 2. 3”条方法进行测定,记录CH峰面积,将所得峰面积值由标准曲线法计算药物含量,并由测定CH质量浓度和实际CH质量浓度计算回收率。结果表明在此条件下,平均回收率均在98. 0% ~ 102. 0% 内,RSD均小于2. 0% ( 表4) ,符合回收率试验要求。

取“2. 2. 5”条质量浓 度为0. 10、0. 20和0. 50 g·L- 1CH对照溶液,于室温环境下避光放置,并在0、2、4、6、8、12和24 h分别取样20μL注入液相色谱仪,记录峰面积,所得CH峰面积的RSD值均小于2. 0% 。结果表明,溶液在室温环境下避光放置24 h内稳定。

将阳离子交换纤维及阳离子交换树脂按常规方法经酸碱处理后,用蒸馏水洗至p H值7. 0,分别取2. 0 mL ( 湿体积) 装于2. 5 m L注射器中,以转速2 000 r·min- 1离心4 min脱水,得阳离子交换纤维干柱及阳离子交换树脂干柱,备用。

将葡聚糖凝胶Sephadex G-50浸泡在蒸馏水中过夜,充分溶胀。取2. 0 m L ( 湿体积) 装于2. 5 m L注射器中,以转速2 000 r·min- 1离心4 min脱水,得葡聚糖凝胶柱,备用。

分别采用浊度法及HPLC-ELSD法测定CH法评价不同粒径的空白脂质体于“2. 3”条所得不同微柱上的回收率。

取不同粒径的空白脂质体100μL各2份。1份以蒸馏水定容至10 m L,摇匀,于波长450 nm处测定吸光度,记为Abefore; 另1份加于阳离子交换纤维微柱的顶端,以转速2 000 r·min- 1离心4 min,收集洗脱液,以蒸馏水定容至10 m L,摇匀,于波长450 nm处测定吸光度,记为Aafter-0。

另取不同粒径的空白脂质体100μL各1份,加于阳离子 交换纤维 微柱的顶 端,以转速2 000 r·min- 1离心4 min; 之后自顶端加入蒸馏水100μL浸润微柱,继续以转速2 000 r·min- 1离心4 min,即洗脱1次,收集洗脱液; 以蒸馏水定容至10 m L,摇匀,于波长450 nm处测定吸光度,记为Aafter-1。

同法,用100μL蒸馏水洗脱2、3、…n次,即得Aafter-2、Aafter-3、…Aafter-n。

回收率根 据公式Rn- A= Aafter-n/ Abefore×100% ,n为洗脱次数( 本实验中n = 0 ~ 4 ) 。实验结果见表5。

取不同粒径的空白脂质体100μL各2份。1份以甲醇定容至10 m L,超声10 min,使其完全破乳后按“2. 2. 3”条方法测定CH质量浓度,记为cbefore; 另1份加于阳离子交换纤维柱的顶端,以转速2 000 r·min- 1离心4 min,收集洗脱液,以甲醇定容至10 m L,超声10 min,使其完全破乳后按“2. 2. 3”条方法测定CH质量浓度,记为cafter-0。

另取不同粒径的空白脂质体100μL各1份,加于阳离子交换纤维柱的顶端,以转速2 000 r·min- 1离心4 min; 之后自顶端加入100μL蒸馏水浸润各微柱,继续以转速2 000 r·min- 1离心4 min,即洗脱1次,收集洗脱液; 以甲醇定容至10 m L,超声10 min,使其完全破乳后按“2. 2”条方法测定CH质量浓度,记为cafter-1。

同法操作,用蒸馏水100μL洗脱2、3、…n次,即得cafter-2、cafter-3、…cafter-n。

回收率根据公式Rn = cafter-n/ cbefore×100% ,n为洗脱次数( 本实验中n = 0 ~ 4) ,为了区别于浊度法测得的Rn- A,作者将CH测定法所得的柱回收率记为Rn- CH,实验结果见表6。

将上述2种评价方法所得的不同粒径空白脂质体于阳离子交换纤维微柱上的回收率Rn- A和Rn- CH进行比较,结果如图3所示。

由图3可知,对于粒径较大的脂质体L1洗脱0次,浊度法与CH测定法所得的柱回收率相差悬殊,但随着洗脱次数增加,浊度法测得的柱回收率增长迅速,洗脱3次,回收率已达到100% ; 而CH测定法测得的柱回收率增长相对缓慢,洗脱4次时回收率才达到100% 。对于粒径较小的脂质体L2洗脱0次,浊度法与CH测定法所得的柱回收率相近,但随着洗脱次数的增加,两种方法测得的柱回收率变化却不同。采用浊度法时仅洗脱1次,回收率就达到100% ,而CH测定法需洗脱3次,回收率才可达到100% 。结果表明,依据柱回收率结果对洗脱次数进行选择时,同1份脂质体,不同的测定方法洗脱次数不同。

按“2. 4. 1”条将阳离子交换纤维微柱用阳离子交换树脂微柱替换后同法操作,以HPLC-ELSD测定浊度法及CH法所得的不同粒径的空白脂质体于阳离子交换树脂微柱上的回收率结果见图4。

结果发现浊度法与CH测定法所得的柱回收率与阳离子交换纤维微柱结果相似。洗脱0次时对于大粒径脂质体L1,两种方法的结果相差较大,而小粒径脂质体L2的结果却较为接近。随着洗脱次数的增加,二者的变化趋势发生了改变。对于L1,洗脱1至3次时,浊度法与CH测定法的结果基本相同,洗脱4次时,柱回收率均符合要求; 对于L2,洗脱1至3次时,浊度法所得柱回收率要大于CH测定法的测定结果。依据浊度法所得结果表明,洗脱1次所得柱回收率便符合要求;而CH测定法所得结果表明,需洗脱3次回收率才达到100%。此结果进一步表明,柱回收率测定方法影响洗脱次数的选择。

按“2. 4. 1”条将阳离子交换纤维微柱用葡聚糖凝胶微柱替换后同法操作,以HPLC-ELSD法分别测定浊度法及CH法对空白脂质体于葡聚糖凝胶微柱上的回收率,结果见图5。

与阳离子交换纤维微柱和阳离子交换树脂微柱不同,以葡聚糖凝胶微柱测定柱回收率时,浊度法和CH测定法所得结果一致,但此结果受脂质体粒径的影响,即小粒径脂质体L2洗脱3次,回收率达100% ,而大粒径脂质体L1则需洗脱4次。

由上述结果可知,浊度法测得的柱回收率结果直接受脂质体粒径影响。因此,浊度法测得的脂质体柱回收率是一个偏离了真实柱回收率的虚假值,作者称它为“表观柱回收率( the apparentrecovery rate of column) ”。与浊度法测得柱回收率不同的是,CH测定法所得脂质体柱回收率不受脂质体粒径的影响,不同粒径脂质体( L1、L2)于不同微柱上洗脱时,二者的柱回收率随洗脱次数的变化趋势基本一致,这说明CH测定法所得柱回收率也不受微柱种类的影响。CH测定法测定的是脂质体本身,该法所测得的回收率才是真实的脂质体柱回收率,作者称之为“实际柱回收率( the actual recovery rate of column) ”。

上述结果也表明,以浊度法测得的“表观柱回收率”结果为依据来决定脂质体洗脱次数是片面的,易对实验造成误导。为了量化“表观柱回收率”偏离“实际柱回收率”的方向与程度,作者又提出“相对偏离度( relative deviation,RD) ”,公式如下:

相对偏离度( RD) = ( 表观柱回收率 - 实际柱回收率) /实际柱回收率×100%

“相对偏离度”为正,表示“表观回收率”大于“实际回收率”; “相对偏离度”为负,表示“表观回收率”小于“实际回收率”; “相对偏离度”为零,则“表观回收率”等于“实际回收率”。“相对偏离度”的绝对值越大,表示“表观回收率”偏离“实际回收率”越大,反之,越小。“相对偏离度”的正负和大小从侧面反映了脂质体粒径大小及其分布,可为选择脂质体分离微柱提供依据。不同粒径脂质体( L1、L2) 于不同微柱上洗脱时,对应的“相对偏离度”结果见表7。

由表7可知,在洗脱过程中,脂质体L1、L2于阳离子交换纤维柱、阳离子交换树脂柱和葡聚糖凝胶微柱上的“相对偏离度”均是由负值依次增大,之后变为正值。不同粒径的脂质体通过同样的微柱,所得的“相对偏离度”不同; 相同粒径的脂质体经过不同种类的微柱,所得“相对偏离度”也不同。即脂质体柱回收率的“相对偏离度”直接受脂质体粒径及微柱种类影响。

微粒给药系统一个普遍特征就是粒径分布,脂质体更是如此。作者对洗脱过程中脂质体的粒径进行了测定,结果见图6。

由图6可知,对不同粒径的脂质体,在洗脱过程中,被洗脱下来的脂质体粒径随着洗脱次数的增加而增大,即小粒径脂质体最先被洗下来,大粒径最后被洗脱下来。另外,脂质体于不同种类的微柱上被洗脱时,洗脱下来的脂质体粒径也不同。

a. 目前,测定CH含量的常见方法包括酶法、皂化-比色法、气相色谱法、液相色谱法和液相色谱-质谱联用法等[20,21],作者运用HPLC-ELSD法测定脂质体中CH的含量具有条件简单、操作方便且所得结果可靠、准确、重现性好的优点。另外,作者在研究中发现,此方法也可用于测定脂质体中HSPC的含量,鉴于原理及操作方法相通,作者先以CH含量为指标来检测脂质体的柱回收率,后续将建立脂质体中HSPC的含量测定方法,并以HSPC含量和( 或) HSPC含量与CH含量的比值( HSPC /CH) 为指标来评价脂质体柱回收率。

b. 用浊度法测脂质体柱回收率的基础是脂质体粒径大小及其分布,不同粒径分布的脂质体与光线的相互作用不同。大粒径脂质体对光线主要表现为反射和折射,小粒径脂质体对光线主要表现为散射,且存在多级散射,因此脂质体浓度与光密度不存在严格的线性关系。另外,在测定脂质体柱回收率时,所有可能导致脂质体粒径变化的因素( 如离心条件、洗脱液的种类和用量、最终稀释介质的种类和用量、渗透压的变化等)[22 - 23]均会对浊度法测得结果产生影响。膜材测定法是以膜材含量为指标评价脂质体柱回收率,更为直接、真实、准确。与浊度法相比,该法具有准确度高、重现性好等优点,更为重要的是,不受脂质体粒径大小及后续处理时能改变脂质体粒径的因素的的影影响响。。

c. 本文作者采用浊度法考察不同粒径脂质体( L1、L2) 在阳离子交换纤维微柱的回收率时,当柱回收率达到100% 时对应的洗脱次数分别是3、1次,而用膜材测定法时,对应的洗脱次数分别是4、3次。由此可见,用“表观柱回收率”确定的洗脱次数直接受脂质体粒径及分布的影响,从而导致不同文献中洗脱次数各异,如骆翔等[24]在用阳离子交换树脂微柱离心法测定盐酸小檗碱脂质体包封率时,洗脱次数为2次; 杨强等[5]在用阳离子交换纤维微柱离心法测定盐酸表阿霉素脂质体包封率时,洗脱次数为3次; 张艳晶等[25]在用混合离子交换树脂柱离心法测定苹果酸舒尼替尼脂质体包封率时,洗脱次数为4次; 牟琳琳等[26]在改良p H梯度法制备盐酸小檗碱脂质体一文中,所用洗脱次数为4次。同理,浊度法在评价其他微粒给药系统时也可能存在类似的问题,因为任何微粒给药系统都会存在粒径大小及分布,所以在测定微粒给药系统柱回收率时,不建议采用浊度法,而应该采用更为科学的膜材测定法。

综上,本文作者首次研究了浊度法和膜材测定法在测定脂质体柱回收率时的差异,并将实验结果公式化,为今后脂质体等微粒给药系统包封率测定中洗脱次数的选择提供了更为可靠的依据,使脂质体柱回收率的评价更为准确、标准、规范。