微生物燃料电池（microbial fuel cells,MFCs）是一种利用电活性微生物的氧化反应将贮存在有机物中的化学能转化为电能的装置[1]，在这一过程中，阳极电活性微生物分解底物（电子供体）生成的电子经外电路传递到阴极，被阴极的电子受体（如O2）消耗，从而产生电流[2].

电活性微生物附着在阳极表面，形成由微生物菌体及其胞外聚合物组成的生物膜结构，并最终发育成电活性生物膜（electroactive biofilm,EAB）与固体电极交换电子，实现电子的快速传递[3].有研究表明，由不能形成EAB的细菌驱动的MFC的电流密度比能够形成EAB的系统低[4]；另外，激光共聚焦观察结果显示，电活性生物膜厚的MFC系统产生的电流密度高于生物膜较薄的MFC[5].一方面EAB内高密度的菌体细胞，能够分泌大量胞外聚合物（extracellular polymers,EPS）从而促进生物膜的形成[6]，另一方面EAB上的菌体能够催化降解更多的底物从而产生更多的电子以实现电子的胞外传递.电活性生物膜的形成受电活性微生物种类、底物、电子传递方式等很多因素的影响，例如，Pseudomonas aeruginosa分泌的吩嗪类物质能够作为电子中介体提高胞外电子在微生物-电极界面间的转移速率，从而提高电化学系统的产电性能[7].

在MFC中，EAB的形成过程需要微生物群体间的信号交流、沟通与协调，此通讯交流机制被称为微生物群体感应（quorum sensing,QS)[8].QS最先是在研究发光的鱿鱼体上的费氏弧菌和肺炎链球菌时发现的，直到1994年，有研究者将这一现象具体概念化[9].在QS机制中，微生物会分泌、释放一些特定的可扩散的信号分子（如革兰氏阴性菌多分泌N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-L-homoserine lactones,AHL）及其衍生物类信号分子（如革兰氏阳性菌多分泌氨基酸和短肽类信号分子）[10]，用于感知细胞浓度变化[11].信号分子的浓度与微生物的数量呈正相关，当信号分子浓度达到一定值时，就会诱导自身基因和结构基因大量表达，调节生物膜相关功能基因的表达.Schaefer等发现在双室MFC阳极的电活性微生物能够以N-酰基高丝氨酸内酯作为QS信号分子，改变生物膜微生物群落的相关基因表达[12].Monzon等在MFC阳极室接种极端微生物Halanaerobium praevalens，转录组分析表明添加外源信号分子AHL会增加与多糖生物合成相关基因的表达从而增强生物膜的形成，且MFC系统的功率密度提高了30%[13].目前已有的对群体感应信号分子的研究种类比较单一，大多是对高丝氨酸内酯类信号分子的研究.

P.aeruginosa是一株典型的革兰氏阴性菌，会受到高丝氨酸内酯类（N-3-O-C4-HSL、N-3-O-C6-HSL、N-3-O-C12-HSL）及喹诺酮类（PQS）信号分子的调控作用；同时P.aeruginosa也是一株被广泛研究的电化学活性模式菌株.现阶段针对P.aeruginosa电化学活性的研究仅在其作为产电菌驱动MFC及其电子传递机制等方面，关于QS信号分子对其产电性能影响的研究较少，因此本文重点研究了在接种P.aeruginosa的MFC中添加QS信号分子对其EAB形态及MFC系统产电性能的影响，以期获得一种调控生物电化学系统产电性能的新方法.

本研究所用的P.aeruginosa PAO1为本实验室保存菌株.

两种QS信号分子N-丁酰基高丝氨酸内酯（N-butyryl homoserine lactone,C4-HSL）、2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮（2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone,PQS）购买于湖北诺纳科技有限公司.

LB培养基（g/L）：蛋白胨10.00、酵母粉5.00、氯化钠10.00;pH 7.0.

阳极液（g/L):Na2HPO4 7.06、KH2PO4 3.00、NH4Cl1、NaCl 0.50、MgSO4·7H2O 0.49、CaCl·2H2O 0.02、葡萄糖2.00.

微量元素液（g/L):CaCl2 1.0 0、CuCl2 0.08、NiCl20.13、ZnCl2 0.13、H3BO3 0.13、EDTA 1.25、CoCl2·6H2O0.13、FeSO4·7H2O 1.0、MnSO4·H2O 1.0、(Al2SO4)3·18H2O1.25、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.13.

阴极液（g/L）：铁氰化钾13.17、NaH2PO4 2.13、Na2HPO44.58、KCl 0.13.

摇床（KYC 100B，上海福玛实验设备有限公司）；超净工作台（SW-CJ-2D，苏州净化设备有限公司）；精密电子天平（FA1104N，美国丹佛仪器有限公司）；高压灭菌锅（GI54DWS，厦门致微有限公司）；酶标仪（Thermo M GO，上海艾妍科技有限公司）；恒温培养箱（Gnp-9160，上海精宏实验设备有限公司）.

实验反应器采用双室MFCs，由阳极室和阴极室两个室并列相通构成，两室有效体积均为30 mL，两室相通处使用质子交换膜（美国杜邦Dupont NRE-211）相隔.质子交换膜使用前用1 mol/L HCl溶液浸泡12 h以上，用超纯水冲洗质子交换膜上的残留HCl溶液.阴阳极电极材料均为碳毡，有效面积为4cm2，碳毡使用前用4 mol/L HCl溶液浸泡24 h，最后用纯水冲洗，使最终pH为7.0，并于60℃烘箱烘干备用，阳极连在外加电源正极上，阴极连在电源负极，外加1 000Ω负载电阻.两端的电极使用钛丝将电流导出，外电路为铜线连接.整个反应装置处于30℃恒温培养箱内，用数据采集器（KEITHLEY 2700数据采集器）采集MFC的两端电压，其值每隔10 min记录到计算机中.当电池电压降到一定数值时，更换阳极液和阴极液.

将甘油保存的P.aeruginosa PAO1在LB平板上划线，37℃恒温培养24 h，待菌落长出后，转接到100 mL液体LB培养基中37℃摇床上过夜培养.

将活化好的菌株按1%接种量接种到LB培养基中，分别加入10μmol/L的C4-HSL和PQS，以不加QS信号分子的实验为对照组，每个实验组设置3组平行.每隔2 h，无菌条件下取样，在酶标仪上测量其OD600，以培养时间（h）为横坐标，OD600为纵坐标，绘制生长曲线.

将活化后的P.aeruginosa PAO1按2%的接种量接种于150 mL已灭菌的LB培养基中，在30℃、200r/min的摇床中过夜培养.将过夜培养的菌液（OD600=2）离心10 min(8 000 r/min），舍弃上清液，将菌体用配好的阳极液进行重悬，实验组分别加入终浓度为10μmol/L的信号分子PQS、C4-HSL，对照组用等量的阳极液代替.阴极装入30 mL阴极液，以上操作均在超净台中进行，实验组和对照组均设3组平行实验.

(1）极化曲线测定：待电池运行稳定后，开路2-3 h，连接一系列的电阻值（10 000、9 000、8 000、7 000、6 000、5 000、4 000、3 000、2 000、1 000、900、800、700、600Ω），并在每个电阻值下测量稳定后的电压值，由式（1）得到电流密度，以横坐标为电流密度（A·m2），纵坐标相应电压（V），作出的曲线即为极化曲线.

(2）功率密度测定：利用公式（2）计算得到功率密度，横坐标为电流密度（A·m2），纵坐标为相应功率密度（W·m2），作出的曲线即为功率密度曲线.式中A代表阳极电极有效表面积，单位m2;R代表外电阻阻值，单位Ω；I代表电流密度，单位A·m2;P代表功率密度，单位W·m2.

(3）循环伏安曲线和电化学阻抗的测定：当电池电压达到最大并趋于稳定时，开路2-3 h，打开电化学工作站（PGSTAT302N,Metrohm）及软件，以铂丝电极作对电极，甘汞电极作参比电极，扫描的电压范围为-0.8-0.8 V，扫描速率为0.02 V/s.利用ZSim-demo软件对EIS光谱进行了拟合，以分析阳极生物膜内阻抗.

(4）蛋白含量的测定：剪取大小合适的碳毡置于离心管中（50 mL），加入10 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液并置于4℃的冰箱中保持1 h.在该时间段内，每隔15 min取出离心管并震荡1 min，确保细胞破碎.经过1 h后，收集提取液，并用10 mL去离子水浸渍碳毡以充分获得残留蛋白.将两部分蛋白提取液混合便得到0.1 mol/L的内含蛋白的NaOH溶液.将该溶液进行重复3次冷冻-溶解处理（冷冻温度为-20℃，2 h；溶解温度为90℃，10 min）后，通过BCA标准方法（BCA蛋白浓度测定试剂盒）进行测定.

(5)HPLC测定绿脓素含量：使用C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm），流动相A，水∶乙酸=100∶0.04,V/V；流动相B，乙腈∶乙酸=100∶0.04,V/V；洗脱方式为低压梯度洗脱，0%B相0.01 min,15%B相2 min,83%B相22 min；柱温为室温；检测波长为280 nm；相流速为1 mL/min；进样量为20μL.样品过0.22μm有机滤膜，装入自动进样瓶中，用HPLC进行测样分析.

(6）扫描电镜样品预处理方法：取不同时期的碳毡放入装有浓度为2.5%、pH 6.8的戊二醛溶液的5 mL离心管中，在4℃冰箱中固定3-6 h，随后用磷酸盐缓冲溶液（0.10 mol/L、pH=6.8）清洗3次，然后依次用浓度为50%、70%、80%、90%的乙醇，分别浸泡10-15 min，最后再用100%的乙醇浸泡3次，每次10-15 min，将处理后的样品用锡箔纸包住，在干燥器中干燥待测.

(7）激光扫描共聚焦显微镜样品预处理方法：将染色液按照SYTO-9∶P∶蒸馏水=1.5μL∶1.5μL∶1 mL的比例，加入同一个离心管，充分混匀.样品放入荧光燃料，室温避光染色10 min.染色结束后，用PBS缓冲液清洗3次，最后将样品浸泡在PBS中即刻拍照（Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜）.绿色荧光用488 nm激光激发，接收波谱设置为510-540 nm.红光用552 nm激光激发，接收光波谱设置为600-630 nm.

QS信号分子能够显著促进微生物的成膜[13]，但在LB培养基中是否对微生物的生长有影响仍有待考察.有研究显示，尽管达到刺激生物膜生长所需添加的外源信号分子浓度可能因系统而定，且必须达到最低阈值才能实现群体感应，而10μmol/L是生物膜形成的最佳作用浓度[14].本研究中，添加终浓度为10μmol/L的C4-HSL、PQS和对照组相比较，P.aeruginosa PAO1的生长趋势并未有明显的促进或抑制作用，在20 h后（菌株生长稳定期）对照组与添加信号分子C4-HSL、PQS的OD600值（D）分别为1.83、1.84、1.90（图1）.因此QS信号分子在LB培养基对P.aeruginosa PAO1的生长没有产生显著影响.

如图2所示，空白对照组阳极生物膜蛋白含量明显较低，在MFC运行的中、后期分别为90.88μg/mL和161.20μg/mL.而添加PQS的MFC蛋白含量在中、后期分别达到168.32μg/mL和354.56μg/mL，中、后期分别比对照组提高了1.85倍、2.2倍；添加C4-HSL的MFC中、后期的蛋白含量分别为161.28μg/mL和345.12μg/mL.另外，添加C4-HSL、PQS的MFC后期比中期的增幅分别为161.44μg/mL和186.24μg/mL，比对照组的中、后期增幅（70.32μg/mL）明显，说明添加QS信号分子促进了生物膜的成熟速率、提高了生物膜的生物量.

在MFC的驯化处理过程中，当MFC输出电压稳定，前后数值变化不大即为启动期结束.从图3中可以看出，对照组MFC在第7个周期完成了驯化启动期，耗时440.56 h，最高电压达到0.22 V；添加信号分子PQS的MFC在第4个周期完成启动期，需要270.66 h，与对照组相比时间缩短了169.9 h左右；而添加C4-HSL的MFC可以迅速启动，在第2个周期完成，只需要150.23 h，比对照组启动期时间缩短了290.33 h.添加C4-HSL的MFC最大电压达到0.26 V，相对于对照组提高18.18%；添加PQS的MFC最大电压为0.27 V，产电相对于对照组提高22.73%.

添加信号分子的MFC启动期时间较短，随着驯化时间的延长，电压逐渐稳定，输出电压高于对照组.启动较快表明添加信号分子使得电活性菌株能够迅速在电极表面富集，促进了生物膜的形成.这与Chabert研究结果相一致，即在MEC的阳极室中添加一定量的外源QS信号分子对MFC生物膜的形成及产电有促进作用[15].

循环伏安曲线（cyclic voltammetry,CV）常用来表示MFC电极生物膜的氧化还原特性.如图4，在-0.4 V到0 V之间存在一对氧化还原峰，添加C4-HSL、PQS的中期最大催化电流分别为1.27 mA、1.53 mA，后期分别为2.76 mA、3.01 mA，而对照组中期、后期最大催化电流分别为0.82 mA、2.03 mA，实验组催化电流显著高于对照组.

根据实验室前期的研究结果可确定-0.4-0 V的氧化还原峰是P.aeruginosa PAO1自身分泌的绿脓素所在的氧化还原峰，因其具有氧化还原的性质而作为电子中介体参与了微生物胞外电子传递的过程[16].峰值的大小反映了电极表面发生氧化还原反应的活性大小，添加信号分子的电极相对活跃，电子中介体（绿脓素）的含量较高.因此，推测添加QS信号分子能够提高P.aeruginosa PAO1绿脓素的合成（详见2.6章节）.

电化学阻抗（electrochemical impedance spectra,EIS）提供了EAB与电极界面之间相互作用的重要信息，被认为是判断产电过程电量高低的重要手段[17].EIS由高频区域的半圆和低频区域的直线组成，半圆直径代表了电荷转移电阻（Rct），一般用来表征EAB的电导率.由图5可知，对照组中、后期的Rct分别为22.29Ω、20.58Ω.添加C4-HSL中期、后期的Rct分别为15.33Ω、10.81Ω，均低于对照组；添加PQS中期、后期的Rct分别为8.73Ω、5.43Ω，比对照分别低13.56Ω、15.15Ω.

随着生物膜的成熟，阳极生物膜的电荷转移电阻逐渐减小，MFC的产电升高；在生物膜形成的中、后期，添加QS信号分子的MFC电荷转移内阻均低于对照组，促进了EAB的电化学活性，提高了MFC系统的功率密度.

如图6，在MFC运行的中期，添加C4-HSL、PQS的MFC的功率密度分别为107.12 mW·m2、119.9 mW·m2，分别比对照组（85.56 mW·m2）提高了25.2%、40.13%；在生物膜形成后期，添加PQS和C4-HSL的MFC的最大功率密度分别为353.44 mW·m2、334.89 mW·m2，相比较于对照组的最大功率密度（267.32 mW·m2）分别提高了32.21%、25.28%.

功率密度的大小与阳极生物膜上的电活性微生物生物量有一定的关系，生物膜上附载的微生物越多，微生物利用有机物的速率越快，加速自身生长代谢及电子传递速率，从而提高系统的产电性能[18].MFC运行的中期与后期均有最大功率密度出现，且后期功率密度高于中期，说明生物膜上的微生物数量增多，生物膜趋于成熟.

在接种P.aeruginosa PAO1的MFC的运行操作期间，常观察到阳极液呈绿色，这是由于P.aeruginosa自身会分泌吩嗪类物质.绿脓素作为重要的吩嗪物质之一，其具有氧化还原活性，可作为P.aeruginosa PAO1的电子中介体，在MFC胞外电子传递中起着关键作用.根据HPLC检测结果可知，添加C4-HSL、PQS的MFC在运行中期绿脓素含量分别为6.3μg/mL、6.9μg/mL，而此时空白对照组仅为4.5μg/mL；添加C4-HSL、PQS的MFC在运行后期绿脓素含量分别为8.9μg/mL、9.2μg/mL，分别比对照组（7.4μg/mL）提高了20.27%、24.32%（图7）.沈海波等研究发现添加槐糖脂可以增加电子中介体绿脓素产量能够有效提高MFC的产电性能，电流密度和功率密度分别增加了1.7倍和2.6倍[19].添加信号分子C4-HSL、PQS均促进了MFC中P.aeruginosa PAO1绿脓素的分泌，因此其生物电化学活性优于对照组.

采用SEM分别对MFC初期、中期、后期的电极生物膜进行了显微结构观察（图8）.在MFC初期对照组生物膜上的生物量较少，而此时添加C4-HSL和PQS的阳极生物膜上菌体生物量相对更多，这与添加信号分子的MFC的启动期明显缩短（图3）相符合.在MFC运行中期，添加信号分子的实验组细胞密度增加速度快，菌量分布密集，而对照组菌量分布依然较稀疏，这与蛋白含量（生物量）检测结果吻合（图2），也进一步从形态上证实添加QS信号分子会促进阳极电活性生物膜的形成.在MFC运行后期，生物膜处于成熟和稳定状态，从图中可以看出附载的菌体细胞堆积，分布紧密，这种结构加速了菌体之间的胞外电子传递，提高了MFC的产电输出.

微生物分泌次级代谢产物作为电子中介体协助电子的胞外传递是MFC电活性生物膜转移电子的重要途径之一.铜绿假单胞菌自身可分泌绿脓素作为胞外电子中介体，随着电极表面生物量的富集，生物膜形成多层基质，电子中介体嵌入其中，实现多层微生物间底物代谢及生物膜顶层与底层的电子转移，进而更好地提升电能[20].添加QS信号分子的实验组生物膜上生物量多于对照组，且分泌的绿脓素多于对照组，因此加速了生物膜表面的电子传递，提高了MFC的产电输出.

对成熟后的生物膜进行活死细胞染色并进行激光扫描共聚焦显微观察.由图9可知，对照组生物膜厚度为80μm，且活死细胞分层明显（活细胞染成绿色，死细胞染成红色），死细胞比例明显增多，且主要分布在靠近电极内侧，因此与阳极的电子传递效率大大降低；而添加PQS和C4-HSL的电活性生物膜厚度分别达到350μm、200μm，且活细胞比例明显较大，细胞的代谢活性显著增强.

Sun等研究发现阳极生物膜的结构会影响EAB的产电性能，但并非整个生物膜都具有生物活性，活死细胞比例决定了生物膜活性的高低[21].本实验中，添加信号分子的实验组生物膜厚度增加，其生物量及其分泌的胞外聚合物相应增多，这也会使整个生物膜结构更加稳定.添加信号分子的实验组活细胞较多，增强对电子供体的氧化代谢及电子传递性能，而对照组活细胞较少，活性较低，降低了整个生物膜的电导率和电子传递效率.

以电活性微生物P.aeruginosa PAO1为研究对象并构建双室MFC，通过添加QS信号分子C4-HSL、PQS来考察其对菌体生长、MFC产电性能、生物膜形态与结构的影响，主要结论如下：

(1）在MFC的驯化过程中，添加信号分子C4-HSL、PQS的MFC启动时间分别为100 h、200 h左右，均短于对照组（400 h）；最大稳定电压分别比对照组提高了18.18%、22.73%.生物膜形成中、后期产电性能（循环伏安曲线、电化学阻抗、极化及功率密度）的结果均表明添加C4-HSL、PQS提高了MFC系统的电导率、功率密度、催化电流，Rct分别减小了9.77Ω、15.15Ω.

(2）添加信号分子C4-HSL、PQS的MFC阳极生物膜蛋白含量在中期、后期均优于对照组，其中后期蛋白含量分别比对照组提高了2.14、2.20倍，绿脓素含量分别是对照组的1.20、1.24倍，说明添加QS信号分子促进了电极表面附载电活性生物膜生物量以及电子传递中介体绿脓素的形成，促进了电活性生物膜与电极界面的胞外电子传递.

(3)SEM结果显示添加QS信号分子的生物膜生物量多于对照组，排列更为紧密；CLSM结果显示添加信号分子C4-HSL、PQS的生物膜厚度分别为200μm、350μm，均大于对照组（80μm），且活细胞比例明显多于对照组.

以上结果说明添加QS信号分子促进了生物膜的形成、改善了生物膜的结构、紧密度及活死细胞比例，增强了整个生物膜的代谢活性，因此从整体上提高了MFC系统的产电性能.此研究结果为以后电化学系统在环境污染治理领域的百富策略白菜网奠定了一定的基础，但其在单菌体系里对污染物的降解效果仍存在一定的局限性，因此关于QS信号分子在MFC中对混菌体系电活性生物膜的作用还有待进一步研究.