可食膜是以天然可食性生物大分子为主要成膜基质, 通过流延、吹塑、自然干燥等工艺, 借助分子之间的相互作用而形成的一种具有一定力学性能和阻隔性能的薄膜[1], 能够阻止溶质、水分和气体等的迁移, 保持食品品质, 延长食品货架期。目前, 国内外关于可食性膜材料的研究已有大量报道, 如用糖类、蛋白质、脂类等生物大分子制膜, 其中玉米淀粉可降解购物袋[2]已经完成工业生产, 走进了人们的日常生活。而植物蛋白质因具有安全无毒、生物相容性高及环境友好等特点, 已成为制作新型可食性膜的优选材料之一, 如大麦醇溶蛋白膜[3]、大豆分离蛋白膜[4]、高粱醇溶蛋白膜[5]等。其中, 高粱醇溶蛋白中含有较多的疏水性氨基酸 (如丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等) , 在水中的溶解度低, 制备的蛋白膜对水和气体均具有良好的阻隔性能[6]。但单一的高粱醇溶蛋白膜较脆, 塑性较差, 限制了其在食品包装领域中的百富策略白菜网。为改善高粱醇溶蛋白膜的性能, Giteru等[7]在高粱醇溶蛋白膜中添加活性物质柠檬醛和槲皮素, 发现二者均可改善其性能;后来Giteru等[5]进一步将柠檬醛/槲皮素-高粱醇溶蛋白复合膜用于新鲜鸡肉的包装与储藏, 与对照组相比, 复合膜组具有维持和改善鸡肉品质的潜力。

研究表明, 多酚类物质可与蛋白质发生相互作用[2], 使得蛋白材料的性能得到改善。郭丛珊等[8]在大豆分离蛋白膜中加入茶多酚, 发现复合膜的拉伸强度和阻水性能显著提升;张慧芸等[9]在玉米醇溶蛋白膜中加入丁香酚类物质, 改善了蛋白膜的机械性能, 增强了蛋白膜的阻隔性和透湿性。丁香酚是自然界中较为常见的一种天然多酚, 具有抗菌、抗真菌、杀虫和抗氧化等良好的生物活性, 且酚类化合物和蛋白质共价键的交联作用很强, 热稳定性能更好[2]。目前有关于酚类化合物对高粱醇溶蛋白膜的研究报道非常有限, 且主要集中在理化性能, 而有关膜的光学属性、热特性、微观结构等反映其变化机理的研究鲜见报道。因此, 本研究以高粱醇溶蛋白为原料, 甘油、聚乙二醇为增塑剂, 添加具有交联作用的丁香酚, 制备丁香酚-高粱醇溶蛋白可食膜, 分析不同浓度丁香酚对可食性高粱醇溶蛋白膜物理性能及微观结构的影响, 并探讨其变化机理, 旨在为高粱醇溶蛋白百富策略白菜网于可降解、可食性膜新材料的后续研究提供理论参考。

白高粱粉 (食品级, 粉末) , 购自西安晋恒化工有限公司;丁香酚 (纯度> 98%, 食品级) 、无水乙醇 (分析纯) 、焦亚硫酸钠 (分析纯) 、氢氧化钠 (分析纯) 、盐酸 (分析纯) , 均购自航景生物科技有限公司。

0～10 mm千分测厚规, 苏州明哲量具有限公司;SpectraMax- i3酶标仪, 美国Molecular Devices公司;TA.XT Plus-01质构仪, 英国SMSTA公司;200-F3型差示扫描量热仪 (differential scanning calorimentry, DSC) , 德国NETZSCH公司;Tensor-27型傅里叶红外 (fourier transform infrared, FTIR) 光谱仪, 德国Bruker公司。

参照李晓晖等[10]的方法。取0.5 kg白高粱粉, 加入2 L 70% (v/v) 乙醇溶液、7 g氢氧化钠 (0.35%, w/v) 和10 g焦亚硫酸钠 (0.5%, w/v) 作为还原剂, 在70℃水浴条件下恒温振荡浸提4 h。将所得混合液离心 (5 000 r·min-1, 10 min) , 保留上清液, 上清液中加入蒸馏水[<10℃, 1∶1 (v/v) ]沉淀蛋白, 用1 mol·L-1盐酸调节溶液pH值至5.5 左右, 缓慢搅拌溶液直至白色絮状沉淀逐渐析出。静置一夜后离心 (5 000 r·min-1, 10 min) 取沉淀, 冷冻干燥蛋白沉淀 (-20℃) , 蛋白沉淀再经正己烷[1∶10 (w/v) ]脱脂后得到高粱醇溶蛋白, 储藏于干燥器中, 备用。

取6.0 g高粱醇溶蛋白, 加入1.48 g增塑剂 (聚乙二醇∶甘油=1∶1, v/v) 和60 mL 85%乙醇溶液, 缓慢搅拌均匀后置于80 ± 2℃的水浴锅中搅拌15 ± 2 min, 再于40 ± 2℃的恒温水浴锅中冷却, 最后用85%乙醇溶液补充挥发的乙醇溶液。各试验组中分别加入0% (对照, CK) 、2%、4%、6%、8% (w/w) 丁香酚, 均质 (6 000 r·min-1) 2 min后于40℃、100 r·min-1条件下搅拌10 min, 以除去气泡。将成膜溶液缓慢倒在玻璃板上 (0.09 g·cm-2) , 50 ± 2℃静止12 h。将干燥成型的膜剥落, 在进行理化试验之前, 将膜置于干燥器中48 h, 以平衡水分。

利用千分测厚规测量膜的厚度 (精确度:± 0.001 mm) 。以膜中心为基准点, 在距离中心点等距离的四角随机取8个点测量膜的厚度, 结果取平均值, 单位μm。

利用质构仪测量膜的拉伸应力 (tensile stress, TS) 、断裂伸长率 (elongation at break, EAB) 。将膜剪成60 mm×10 mm的条状, 初始夹距设为40 mm, 拉伸速度设为1 mm·s-1。试验之前将样品提前24 h放于干燥器中平衡水分。

用打孔器取直径为6 mm的膜样品紧贴于微孔底部, 利用酶标仪测定样品在200～800 nm范围内的吸光度值, 扫描波长间隔5 mm。

参照McHugh等[11]的方法。在5 mL的小烧杯中加入5 mL去离子水, 用可食用膜 (4 cm×4 cm) 密封烧杯口, 然后置于干燥器中。间隔1.5 h称重一次, 得到样品质量相对于时间变化的斜率。按照公式计算水蒸气透过系数 (water vapor permeability, WVP) :

WVP=WVTR×LΔP×100%         (1)$\text{W}\text{V}\text{Ρ}=\frac{\text{W}\text{V}\text{Τ}\text{R}\times \text{L}}{\text{Δ}\text{Ρ}}\times 100\%(1)$

式中, WVTR (water vapor transmission rate) 为膜的水蒸气透过率 (g·h-1·m-2) , 由质量随时间的变化率除以膜的封口面积 (m2) 得到;L是膜的平均厚度 (mm) ;ΔP为膜两侧水蒸气分压差 (kPa) 。

参照Ahmad等[12]的方法。取28～32 cm2膜样品, 于105 ± 2℃鼓风干燥箱中烘干至恒重, 记为 Wi。将样品浸没在40 mL去离子水中, 用封口膜封住容器口, 室温下浸泡24 h后用滤纸过滤溶液, 将滤纸和滤渣于105 ± 2℃鼓风干燥箱中烘干至恒重, 记为Wf。按照公式计算膜的水溶性 (water solubility, WS) :

WS=Wi−WfWi×100%         (2)$\text{W}\text{S}=\frac{W{}_{\text{i}}-W{}_{\text{f}}}{W{}_{\text{i}}}\times 100\%(2)$

式中, Wi为膜初始重量, Wf为滤渣最终重量。

参照Chen等[13]的方法。用分析天平称取10～15 mg样品, 置于铝制坩埚中压片封口, 放入DSC仪中。用空铝皿作为参照, 氮气作为保护气和吹扫气, 流量分别为60 mL·min-1、20 mL·min-1。以10℃·min-1的升温速率从20℃加热至140℃。

参照Gu等[14]的方法。称取0.2 mg干燥至恒重的样品, 加入2 mg溴化钾在研钵中研磨, 取适量研磨均匀样品压片, 在波长400～4 000 cm-1的范围内进行扫描, 得到样品在不同波长下的吸光度。

对样品红外光谱进行傅里叶变换去卷积, 用PeakFit 4.11进行二阶导数拟合, 得到子峰数目在8～12之间, 其残差 (r2) 大于0.999。确认峰位归属, 计算各分峰面积的相对百分含量。

参考邹小波等[15]的方法。取1 cm×4 cm膜样品, 液氮浸没后进行人工折断, 将样品粘贴于金属圆台上, 真空状态下喷金, 然后置于扫描电镜中, 电子束加速电压设为10.0 kV, 在放大倍数1.0 K下拍照记录。

试验数据均为3次重复的平均值, 采用SPSS 17.0软件对数据进行处理, 用AVOVA法对数据进行方差分析, Duncan多重检验进行数据间的差异显著性分析 (P<0.05) 。百富策略白菜网Origin 9.0绘制图形。

由表1可知, 高粱醇溶蛋白膜的厚度在116.56～136.11 μm范围内, 符合美国材料与实验协会 (ASTM) 的标准 (≤250 μm) [16]。随着丁香酚浓度的增加, 蛋白膜的厚度呈先降低后增加的趋势, 当丁香酚浓度为4%时, 膜厚度有最小值 (116.56 μm) , 这是因为在一定浓度范围内添加丁香酚, 高粱醇溶蛋白各组分间的疏水性相互作用降低, 蛋白分子与多酚之间的氢键作用加强, 从而膜内部交联更加紧密, 膜的厚度降低。结果表明, 4%浓度的丁香酚更有利于蛋白分子之间的交联。

由表1所示, 对照组 (CK) 高粱醇溶蛋白膜的TS为111.68 N·mm-1, 当丁香酚浓度≤4%时, 随着丁香酚浓度的增加, 复合蛋白膜的TS增大;当丁香酚浓度大于4%, 随着丁香酚浓度的增加, 复合蛋白膜的TS减小。添加4%丁香酚时, 复合蛋白膜的TS值为127.19 N·mm-1, 与CK相比, 增加了13.89%, 这是因为多酚中的羟基和蛋白分子中的氨基酸残基和羧基结合形成氢键, 故分子间的作用力增加[17]。丁香酚浓度为4%时, 复合蛋白膜的EAB值为190.07%, 较CK增加了70.54%。综上, 丁香酚浓度为4%时, 丁香酚/高粱醇溶蛋白复合膜的机械性能有最优值。

由图1可知, 在紫外波长 (230～400 nm) 范围内, CK和试验组蛋白膜均出现一个吸收峰, 这是因为高粱醇溶蛋白中含有带苯环结构的芳香族氨基酸 (酪氨酸和苯丙氨酸) , 其对紫外光具有一定的吸收能力[2]。添加不同浓度的丁香酚后, 吸收峰的吸光度值更高, 这是因为丁香酚中的苯环结构和不饱和键对紫外光也具有一定的吸收能力。在可见光波长范围 (400～800 nm) 内, 随着波长的增加, 蛋白膜的吸光度值逐渐降低, 添加不同浓度的丁香酚后, 蛋白膜的吸光度值均有不同程度的增加。

由图2可知, 随着丁香酚浓度的增大, 丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的水溶性显著增加 (P<0.05) , 当丁香酚浓度为4%时, 相比CK, 膜的水溶性增加了7.1%, 增幅最小, 更适合作为高粱醇溶蛋白膜的改性剂。添加不同浓度的丁香酚后, 丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的水蒸气透过系数 (WVP) 无显著变化, 这是因为膜的WVP不仅与膜的性能相关, 也受到醇溶蛋白分子中极性基团的共价键、丁香酚分子内部羟基及膜中水分子扩散路径的影响[18]。

由图3可知, CK醇溶蛋白膜的Tg值为76.97℃, 随着丁香酚浓度的增加, 丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的玻璃态转变温度 (glass-transition temperture, Tg) 值呈先下降后上升的变化趋势。其中, Tg值下降是因为加入丁香酚, 多酚中的羟基与蛋白分子结合形成氢键, 混合体系的疏水性降低、亲水性增加。当丁香酚浓度为4%时, 高粱醇溶蛋白复合膜的Tg值有最小值, 为60.16℃。

由图4可知, CK高粱醇溶蛋白膜的酰胺A峰 (O-H伸缩振动峰[10]) 在3 407 cm-1处, 随着丁香酚浓度的逐渐增大, 复合膜的酰胺A峰先红移再蓝移, 分别为3 398、3 383、3 395、3 397 cm-1。添加不同浓度丁香酚, 酰胺B峰 (-CH3和-CH的反对称伸缩振动峰[19]) 由2 944.8 cm-1小幅度红移至 2 943.8、2 942.8、2 943.8、2 944.8 cm-1。Herrero等[20]研究发现-CH峰的位移受氨基酸残基的疏水性影响, 由此表明, 添加丁香酚影响了高粱醇溶蛋白氨基酸残基的疏水性, 该结果印证了复合膜的水溶性增加及Tg值降低的变化趋势。

1 600～1 640 cm-1、1 640～1 650 cm-1、1 650～1 660 cm-1及1 660～1 700 cm-1之间的峰面积分别表征β-折叠、无规则卷曲、α-螺旋和β-转角含量[19]。由图5可知, 随着丁香酚浓度的增加, 复合膜的β-转角含量增加, 当丁香酚浓度为4%时, β-转角含量出现最大值;α-螺旋、无规则卷曲含量随着丁香酚浓度的增加而降低, 当丁香酚浓度为4%时, 两者有最小值。这是因为添加丁香酚改变了复合膜内部蛋白质的二级结构, α-螺旋、无规则卷曲结构转化成β结构[10]。

由图6可知, CK膜的表面和截面粗糙, 有较多蛋白颗粒和小孔, 蛋白溶解性不好;添加2%丁香酚, 膜截面平滑度增加, 蛋白颗粒减少了, 小孔数量降低了, 表明丁香酚与蛋白相容性较好;添加4%丁香酚, 膜的微观结构发生变化, 膜表面小孔数量明显降低, 截面光滑紧致, 表明醇溶蛋白与丁香酚分子间结合良好, 膜内部分子排列有序;继续增加丁香酚浓度, 膜截面变得疏松, 小孔增多。该结果与机械性能和二级结构的结果相对应, 蛋白膜内部小孔数量越少, 膜表面越平滑, 二级结构中的β结构含量越多, 机械性能相对越好[21]。

本试验结果表明, 当丁香酚浓度为4%时, 丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的厚度、水溶性均有最优值, 同时, 显著提升了膜的TS、EAB, 增加了膜对紫外光和可见光的阻隔性, 且基本不影响复合膜的WVP。添加一定浓度的丁香酚后, 丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的TS、EAB增大, 表明随着丁香酚浓度的增加, 高粱醇溶蛋白分子间的疏水性相互作用减弱, 多酚类物质中的羟基与醇溶蛋白分子中的氨基酸残基和羧基结合形成氢键占据主导, 故膜基质内部交联更加紧密, 膜的强度增加。但当丁香酚浓度超过4%后, 蛋白分子周围聚集大量酚类物质的羟基, 打断了原有醇溶蛋白分子间的有序排列, 多肽链间的流动性增大, 因此膜内部分子之间的交联减弱, 拉伸应力降低, 延展性持续增加。丁香酚浓度为4%时, 膜的EAB值为190.07%, 优于Giteru等[7]制备的柠檬醛、槲皮素高粱醇溶蛋白膜的EAB (147.0%) 。高粱醇溶蛋白是一种疏水性蛋白质, 用其制成的蛋白膜结构致密, 对环境中的水蒸气有很好的阻隔性能, 较已经商业化生产的大豆分离蛋白膜、鱼鳞明胶膜, 高粱醇溶蛋白膜的阻水性能更好。Otoni等[22]在大豆分离蛋白中加入丁香酚, 复合膜的水蒸气透过系数为1.06 ×10-10g·s-1·m-1·pa-1, 是本试验中高粱醇溶蛋白膜水蒸气透过系数的13.6倍;Nazmi等[23]用鸡皮明胶制作明胶膜, 其水蒸气透过系数高达1.36×10-4g·s-1·m-1·pa-1, 为本试验中高粱醇溶蛋白膜的106倍。膜的吸光度值越高, 透光率值越低, 光阻隔性能越好。当丁香酚浓度为4%时, 丁香酚/高粱醇溶蛋白膜对紫外、可见光的阻隔性能均出现最优值。综上表明, 添加4%丁香酚的高粱醇溶蛋白复合膜的性能最优。

蛋白分子间的疏水性相互作用使得蛋白分子聚集在一起[24], 从而保证膜内部结构的完整性。在高梁醇溶蛋白中加入丁香酚, 随着多酚浓度的增加 (2%、4%) , 醇溶蛋白分子中的氨基与羰基同多酚物质中的羟基形成氢键, 增加了蛋白多肽链间的连接, 因此FTIR图中的O-H峰低波数位移, 宏观表现为丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的机械性能增大、水溶性增加。Iman等[25]指出, 蛋白分子间作用力增强时, 会伴随着吸收峰的红移, 本试验中分子间相互作用呈现先增强后减弱的趋势, 这与复合膜的拉伸强度变化相一致。本研究中, 添加丁香酚后, 复合膜的Tg值呈现先降低后增加的变化趋势。Ghanbarzadeh等[26]研究发现, 亲水性强的乳清蛋白膜的Tg值低于玉米醇溶蛋白膜的Tg值, 基于此研究, Huo等[27]指出, Tg值和材料的疏水性能成正比。因此, 本试验中添加丁香酚后醇溶蛋白膜的Tg值降低印证了添加丁香酚后复合膜水溶性略微变大的结果。

本研究结果表明, 各试验组膜的表面和截面均含有不同数量的小孔, 这是因为高粱醇溶蛋白中含有较多的疏水性氨基酸, 在成膜过程中添加的亲水能力较强的甘油、聚乙二醇很难与高粱醇溶蛋白中的疏水集团结合[28], 使得部分甘油和聚乙二醇从膜内部迁移到膜的表面, 从而在膜的内部形成孔径, 表现为膜截面的小孔。在一定浓度范围内添加小分子物质丁香酚, 复合膜中的氢键能较好地降低混合体系内部的吉布斯自由能, 使各组分很好的相容[22], 因此, 膜表面小孔数量降低。添加4%丁香酚与高粱醇溶蛋白相容性良好, 膜截面光滑紧致, 表面平整。

本试验结果表明, 添加4% (w/w) 丁香酚后, 丁香酚/高粱醇溶蛋白可食性复合膜的水溶性略微增加, 但复合膜的拉伸应力 (TS) 和断裂伸长率 (EAB) 提升, 且对紫外光和可见光的阻隔性增加, 表明添加丁香酚有利于开发机械性能高、阻隔性能好、热稳定性能优良的高粱醇溶蛋白膜材料, 这解决了高粱醇溶蛋白膜材料黏性、延伸性及抗拉强度差的问题, 其机械性能可满足实际生产需要。现有技术的研究主要是试验室规模的操作和在食品中的百富策略白菜网, 接下来需进一步优化蛋白质膜制备技术, 提高可食性膜的物化性质。